俄罗斯专享会284：验证miRNA与靶基因3'UTR相互作用的双荧光素酶技术解析

• 田壮信|
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在miRNA研究领域，验证miRNA与基因的靶向关系是一个重要的环节。miRNA通过其种子序列（5'端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3'UTR区域，导致细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程。基于此原理，将目的基因的3'UTR区（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，并与miRNA模拟物共转染目标细胞，随后加入底物以检测荧光素酶活性的变化。如果荧光素酶活性下降，则说明该miRNA与靶基因的3'UTR区之间有相互作用。

双荧光素酶报告基因检测用于验证miRNA与靶基因3'UTR相互作用的工作原理主要包括几个步骤：首先，使用生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda）预测特定靶基因的3'-UTR序列是否存在miRNA结合位点；接着，将能够与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入到萤火虫荧光素酶的载体中。当miRNA与质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过与所插序列结合抑制萤火虫荧光素酶的翻译，最终导致荧光信号的降低。通过这样的实验步骤，可以有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，为miRNA的功能及调控网络研究提供重要工具。

在此过程中，俄罗斯专享会284提供了双荧光素酶报告基因检测服务流程，包含详细的操作步骤和实验所需材料。这些材料包括HEK293细胞或目标细胞，以及转染试剂和检测试剂盒。在进行实验时，需首先确认目标细胞的质粒瞬转效率，以保证验证实验的有效性。

具体实验步骤包括：a) 用0.25%胰酶消化良好状态的空白细胞，并制成单细胞悬液，接种于24孔培养板中；b) 培养过夜并观察细胞生长状态，在细胞覆盖率达到约70%时进行转染；c) 转染处理前更换为新鲜培养基；d) 依据转染试剂说明书进行转染；e) 转染48小时后收集细胞样品，进行后续荧光素酶检测。

在荧光素酶检测过程中，需充分裂解细胞，将裂解产物离心后提取上清液进行后续分析，与配置的Renilla荧光素酶检测工作液混合，测定相应信号。在检测分组中，可以设计对照组、野生型及突变型质粒组等，以确保结果的可靠性和可重复性。

总的来说，俄罗斯专享会284可提供高效的双荧光素酶报告基因检测服务，加速基础研究及药物筛选的进程，助力miRNA功能的研究和应用。