肠道免疫细胞分离指南 - 俄罗斯专享会284

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实验前准备与试剂配制

在进行免疫细胞分离实验之前，首先需要准备相关试剂。根据实验要求，配制40%和80%的Percoll溶液。40% Percoll溶液的制备方法为：将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）按照9:1的体积比例混合，得到等渗的100% Percoll母液。随后，将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS按照4:6的比例混合，从而制得40%等渗Percoll溶液。同样，80% Percoll溶液的制备则是采用相同的步骤，但体积比调整为8:2。

肠道固有层免疫细胞分离步骤

以下是小鼠肠道固有层免疫细胞的分离操作步骤：

1. 采用颈椎脱臼法迅速处死小鼠，并将其固定在手术台上。用75%酒精对小鼠腹部进行消毒，沿正中纵向剪开以暴露腹腔。
2. 在小鼠胃与十二指肠相连的位置剪断，同时分离小肠周围的脂肪组织和肠系膜，轻轻拉出小肠，然后在小肠与盲肠连接处剪断，从而完整分离出小肠。
3. 将分离出的小肠放入含有5mL 4°C预冷PBS的10cm培养皿中进行润洗，使用镊子和剪刀逐步去除脂肪组织和派伊尔结。
4. 将小肠切割成四段，用剪刀纵向剪开以暴露肠内容物，并轻轻地用刮刀将肠内容物从粘膜表面刮除。
5. 将处理后的小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒，随后使用镊子取出小肠进行两次清洗。
6. 清洗后的肠组织剪碎成0.5cm的小片段，100-200mg的组织块转移至2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，37°C下轻轻摇晃孵育60分钟（根据组织状态适当延长孵育时间）。
7. 从摇床中取出圆底管，剧烈涡旋10-20秒，通过70μm细胞筛网进行过滤，并用10mL PBS冲洗细胞筛网。
8. 收集含有细胞的滤液至50mL离心管中，以20°C、400g离心5分钟，弃去上清液，用4mL 40% Percoll重悬细胞沉淀并转移至15mL离心管。
9. 小心地从15mL离心管底部吸取25mL 80% Percoll，试管稍微倾斜，将4mL 40% Percoll与细胞混合液沿管壁缓慢加入，形成密度梯度。
10. 在800g、20°C下离心20分钟，升速1，降速1。
11. 离心后，吸取离心管中间白膜层的免疫细胞至新的15mL离心管，加入3倍体积的4°C预冷PBS，上下颠倒混合，400g离心5分钟，弃去上清。
12. 重复第12步操作，得到肠道固有层淋巴细胞。
13. 使用细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×106 cells/mL，将100μL/管的细胞悬液分配至12×75mm的流式管中，以备后续实验。

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