整个操作过程大约需要1小时,包含匀浆、细胞裂解、去除蛋白、DNA纯化等步骤,具体操作如下所述。
在从动物组织提取基因组DNA时,需根据实验材料选择不同的匀浆步骤。以下是使用研钵进行匀浆的具体操作:
1. 取1~100mg的动物或人类组织,放入提前冷却的研钵中,迅速用力研磨成匀浆。请注意,对于以下组织,需使用液氮研磨至粉末状:
2. 加入650μl的Solution A及0.9μl的RNase A1后,温和研磨30秒。若使用上述组织材料,在此步骤后将研钵置于65℃水浴中研磨1分钟。
3. 将650μl的匀浆液转移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650μl,请补充Solution A至650μl,并在65℃水浴中保温5分钟。
1. 根据下表选择适量的新鲜植物材料(如使用冷冻干燥植物材料,则用量减半),剪成小块并放入研钵中,加入液氮后迅速研磨至粉末状,注意期间分次加入液氮以防止材料融化。
植物材料 | 使用量 |
植物花、叶片 | 10~100mg |
植物茎 | 60~240mg |
植物根 | 80~240mg |
植物种子 | 80~240mg |
2. 若取植物根、种子等样品,应使用超过表中参数用量,并将样品分成两个管进行操作,最后再将两管溶液合并至同一Spin Column进行过滤。
3. 对于培养的植物细胞,离心收集2×103~1×107的细胞,加入150μl水后充分悬浮,再与液氮混合研磨。
4. 当研磨样品粉末开始融化时,加700μl的Solution A和12μl的RNase A1,研磨30秒。
5. 将650μl匀浆转入Collection Tube。如不足650μl,补充Solution A至650μl,65℃保温15分钟。处理富含纤维的根或茎类材料时,可延长水浴时间至60分钟。
1. 取10~250μl的全血(含抗凝剂)放入Collection Tube中。
2. 加入500μl的Solution A。
3. 加入1μl的RNase A1,强烈振荡15秒后冰浴5分钟。
请注意,人与动物的抗凝全血一次处理量不超过250μl;禽类和两栖类则为不超过10μl。
对于悬浮培养的动物细胞:
1. 使用Collection Tube收集1×105~15×107的细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟并弃上清。
2. 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。
3. 加入500μl的Solution A和0.8μl的RNase A1,剧烈振荡15秒后在室温下静置1分钟。
以上步骤均可依赖俄罗斯专享会284产品进行操作,确保提取的基因组DNA高效且纯净。